公司新闻
公司新闻
公司新闻
当前位置:首页 > 行业资讯 > 公司新闻
当前位置:首页 > 行业资讯 > 公司新闻

抗菌肽产品的开发难点

时间:2021-09-29 浏览:190次
详细说明


抗菌肽


抗菌肽又称抗微生物肽或宿主防御肽,是生物体经诱导产生的具有广谱抗菌活性和免疫调节活性的一类小分子多肽,属于机体非特异性防御系统的固有组成部分,几乎存在于所有生命形式中。抗菌肽通常由12-50个氨基酸组成,相对分子质量一般在2-5 kDa左右。研究发现,抗菌肽具有快速杀菌广谱抗菌活性,包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、多重耐药细菌、真菌、寄生虫、包膜病毒和肿瘤细胞,并能在先天免疫和获得性免疫之前起到桥梁作用,通过启动获得性免疫系统提高机体抵抗微生态感染的能力。迄今为止,已发现超过3000种抗菌肽。

基于全球无抗政策的推动,抗菌肽无残留、无耐药性、无配伍禁忌、无停药期,无毒安全等优势,是现代医学研究最热点之一。目前抗菌肽的生产方式主要有三种:天然提取、化学合成和生物工程发酵。天然抗菌肽主要来自动植物,含量极低,提取过程甚为复杂;化学合成方法高昂,每公斤成本上千万人民币,不适合工业化生产,无法广泛普及应用。生物工程发酵是利用发酵技术实现产业,具备质量稳定、成本低等优势,是业界公认的规模化生产的最佳途径。但商品化抗菌肽开发并非一蹴而就,有以下几个难点。


01


抗菌肽的生物学活性

目前学术界对抗菌肽的抗菌机制的认识主要有以下两种观点,其一是抗菌肽作用于细胞膜。抗菌肽物理作用于细菌的细胞膜上,使细胞膜穿孔并溢出细胞质,从而达到杀死细菌。抗菌肽具有疏水性和亲水性的两亲性质,因此抗菌肽带正电荷的分子和细胞膜磷脂分子上的负电荷形成静电吸附结合到膜上,然后疏水端将分子插入膜中,从而使整个分子被吸入质膜,这就破坏了蛋白质和脂质在质膜上的原始排列,形成跨膜离子通道,大量离子丢失,细菌无法维持所需的胞内渗透压而死亡。抗菌肽杀菌第二种观点是与细菌胞内的靶点结合,从而达到抑制或杀灭细菌的作用。抗菌肽可以直接作用细胞内关键的生物合成过程,例如抑制DNA复制、RNA转录、蛋白质的合成,抑制细胞壁的合成,改变细胞质膜通透性,抑制合成酶的活性和激活菌体自溶等,如肠杆菌肽抑制细菌的RNA聚合酶。也有一些抗菌肽可以通过影响多个生物合成过程来起到多渠道杀灭细菌。




图片



在筛选抗菌肽的前期研发,首先需要研究抗菌谱,即抗菌作用的面是否广泛,是否和现有临床疾病相对应,其次还需要研究抗菌强度,一般用最小抑菌浓度(MIC)来表示,例如一个抗菌肽对某一个病原菌有抗菌活性,但MIC值太高,即需要使用超大剂量才能达到有效性,这样的产品也是没有价值的。如肠杆菌肽对大肠杆菌的MIC<0.5ug/mL,对沙门氏菌MIC<0.1ug/mL,抗菌效果好的产品开发才会有市场价值。




图片



02


抗菌肽的稳定性

抗菌肽产业化应用的另一个问题就是大部分抗菌肽稳定还不够理想,因为抗菌肽作为多肽类物质,耐高温、耐酸碱性能不是特别强。


抗菌肽属于生物活性多肽,在生物发酵过程中宿主菌大都会产生很多蛋白酶,这些蛋白酶对多肽有降解的活性,这样就会造成生产出来的抗菌肽在发酵过程中就被降解损耗掉,失去生产价值。在生产过程中,抗菌肽物料还需要由液体经过加工变为固体,这些过程都需要热源,如果一个抗菌肽不耐热,一样失去生产价值。


同时我们开发抗菌肽的作用最重要的一个使用途径是经口给药,抗菌肽有可能被消化道内的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胆汁酸等物质会降解,导致无法发挥其生物学活性。对于口服给药的多肽类产品来说,难度是非常大的。


多肽物质,结构决定性质。如肠杆菌肽为锁套肽,其中N端的8个氨基酸形成一个圆形的环状结构,9-21个氨基酸形成尾巴,贯穿圆环,故其性质超级稳定,对高温、酸、碱、胃蛋白酶、胰蛋白酶有良好的抵抗力。枯草菌肽有两个二硫键,这些空间结构决定了性质的稳定性。当然有些抗菌肽本身不稳定,科研工作者为了解决这个问题,提出很多方案以防止抗菌肽在体内被降解,如:分别对肽链的氨基端和羧基端进行乙酰化和酰胺化修饰、将线性肽链进行首尾环化处理以提高稳定性、形成聚乙二醇肽增强抗水解酶能力、脂质体包裹抗菌肽使其缓慢释放等方案。这些方案一定程度上缓解了抗菌肽的降低,但是带来的副作用就是产量降低,影响活性、工艺更加复杂,大大提高了抗菌肽的生产成本。




图片



03


抗菌肽的生产效率

抗菌肽具有广阔的应用前景,但是在制药、食品、畜牧业等行业中大规模应用的主要问题就是生产成本太高。抗菌肽大规模生产的主要限制条件之一就是成本问题,因此生产效率的高低直接决定是否可以大规模应用,特别是在农牧等对成本要求苛刻的领域。


前文分析,天然提取和化学合成都不适合抗菌肽的产业化,生物工程发酵时唯一可行方法,但也有很多难点。目前文献报道的抗菌肽生产水平只有1-150mg /L ,如Chen等学者利用SUMo融合表达技术在枯草芽孢杆菌表达系统中成功表达了抗菌肽 Cecropin AD,摇瓶发酵液中产量为30.6mg/L;Bi等在大肠杆菌BL21中成功融合表达了杂合肽LfcinB-Melittin,通过检测发酵液的含量为35mg/L;另有学者Cao使用毕赤酵母表达系统表达了鸡的防御素Avian β-defensin6,发酵液中含量达到了114.9mg/L。我国科研人员在抗菌肽生产水平上实现了巨大突破,据报道农业农村部饲用抗生素替代技术重点实验研究的抗菌肽发酵水平是文献报道的100倍左右。




图片



04


抗菌肽的纯化工艺

抗菌肽纯品的获取很难。抗菌肽的分离纯化是获取过程中的一项关键环节,不管是天然的抗菌肽,还是基因工程技术获得的抗菌肽,抗菌肽在分离纯化基质中的占比都很小,存在大量的杂蛋白及其他物质,对于成分未知或者结构复杂的抗菌肽就难度更大。所以,分离纯化抗菌肽的关键在于不仅要得到单一的多肽,而且要保证获取多肽的生物学活性,这是进行下一步科学研究的基础。抗菌肽是一类小分子多肽,不同多肽的氨基酸序列及空间结构不同,导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异,利用待分离多肽与其它蛋白质性质上的差异,即可以设计出一套合理的多肽纯化方案。在发酵液中,抗菌肽的占比不到1%,如果去掉99%的杂质,获得纯度大于99.6%的抗菌肽单体是一项艰巨的科研工程。

图片

05


建立抗菌肽检测质量标准

关于抗菌肽的评价方法有两大类,一类是检测抗菌肽的抗菌活性;主要使用扩散法测定。原理是不同浓度的抗菌肽与作用于培养基中的菌种,抗菌肽杀死细菌从而会形成大小不同的抑菌圈,根据圈的大小,就可判定出抗菌肽的抗菌活性。同样,一般在0.5麦氏浓度的菌悬液中加入不同浓度的抗菌肽,抗菌肽会不同程度的影响菌悬液的生长,根据吸光度的高低,可以判断抗菌活性的强弱。抗菌活性检测方法最大的问题是无法区分微生物发酵液中其他组分对抑菌结果的影响,如发酵液的培养基、pH等都会有一定的抑菌活性。更有甚者,在产品中加入其它抑菌物质冒充抗菌肽。这种抗菌活性检测方法操作简单,人员设备要求低,是目前大多数抗菌肽研究所采用的方法,但不能确定产品中是否真实含有抗菌肽,只能表明该产品由抑菌活性。在抗菌肽的质量标准建立过程中,该方法只能作为辅助使用。


一类是定性定量检测方法,一般用的是高效液相色谱法和毛细管电泳。毛细管电泳设备投资大,一般研究单位使用较少。HPLC对混合物中复杂组分的分离能力强,也可以与其他技术联合使用对物质进行准确的定性、定量分析。不同理化性质的抗菌肽可以用不同分离原理的色谱进行分离,如极性大的抗菌肽可以用亲水色谱进行分离,不同电荷的抗菌肽可以用离子交换色谱分离,但科研工作中最常用的还是反向高效液相色谱法,也是学术界公认的多肽类物质检测最科学的方法。如李波研究了高效分泌天蚕素的枯草芽孢杆菌宿主菌的中试发酵工艺,用反向高效液相色谱法检测天蚕素含量达到961.52μg/m L。




图片




图片



06


研发投入成本高

抗菌肽属于多肽类生物药,一种新药从最初发现先导化合物到最终上市,需要经历漫长过程。前瞻产业研究院报告显示,国际上一种新药的成本已经超过10亿美元,研发周期超过10年。但与发达国家相比,我国创新药物研发仍处于劣势,无论是研发投入能力还是产出方面与发达国家均有一定差距。新药研发资金需求高、投入时间长,需要政策与资本的双重支持。


综上所述,抗菌肽产品的开发困难重重,需要广大科研工作者攻坚克难。随着抗菌肽研究的不断深入以及生物技术的发展,希望未来有更多、更好的抗菌肽产品能够产业化,从而能够促进整个医药行业的发展。

图片



走进颖泰行业动态科技创新产品中心联系我们

电话:0372-6123611
版权所有:中农颖泰林州生物科园有限公司  

走进颖泰
  • 公司简介
  • 企业文化
  • 企业资质
  • 企业荣誉
  • 行业动态
  • 公司新闻
  • 行业动态
  • 科技创新
  • 研发平台
  • 研发团队
  • 科研成果
  • 产品中心
  • 添加剂
  • 动保、兽药
  • 原料
  • 案例展示
  • 联系我们
  • 电话:0372-6123611
  • 传真:0372-6123612
  • 邮箱:znytlz@126.com
  • 网址:http://www.zhnyt.com
  • 地址:河南省林州市产业集聚区鲁班大道8号
  • 微信公众号

    豫ICP备18022959号-1